Aislamiento, purificación y producción de proteínas de plasma seminal bovino y evaluación de su actividad en procedimientos de criopreservación espermática
Las proteínas de bajo peso molecular (<16 kDa) en el plasma seminal se han relacionado con los parámetros de calidad seminal y además con la congelabilidad del semen. Se presume que la adición de estas proteínas podría mejorar la calidad seminal post-descongelación. Como objetivo general, en este trabajo se plantea la evaluación del uso de proteínas de plasma seminal de la raza Sanmartinero en procesos de criopreservación de espermatozoides bovinos. Además, se pretende establecer un sistema heterólogo para producción de proteínas de plasma seminal que puedan ser usadas en protocolos de criopreservación seminal. Para esto, se obtuvieron fracciones cromatográficas del plasma seminal de toros criollos Sanmartinero, separadas mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Dichas fracciones se analizaron por electroforesis y se seleccionaron las fracciones IV y V. Para las pruebas de actividad biológica se evalúo la calidad seminal post-descongelación de pajillas congeladas con diferentes dosis de cada fracción. La calidad seminal post-descongelación fue evaluada en función de la motilidad individual y progresiva mediante el sistema C.A.S.A a las 0, 2 y 4 horas y la evaluación de la viabilidad espermática. Los resultados evidenciaron que al adicionar 62.5 μg x 106 espermatozoides (spz) de la fracción V y 125 μg x 106 spz de la fracción IV hubo un aumento en la viabilidad espermática del 9 y el 6 % respectivamente. Las evaluaciones de motilidad evidenciaron un aumento cercano al 34% post-descongelación y de casi el 40 % luego de dos horas de descongelación cuando se adicionaron 15.62 μg x 106 spz de la fracción V. Estos resultados demuestran que el efecto de adicionar proteínas específicas sobre la calidad seminal post-descongelación es dosis-dependiente, y que dosis bajas de las fracciones evaluadas permiten una mejoría tanto en la viabilidad como en la motilidad. En vista de los resultados anteriores se propuso la expresión heteróloga de aSFP, una de las proteínas encontradas en las fracciones IV y V. Para esto, la secuencia disponible GENGANK fue clonada en el plásmido pDass que se usó para transformar una la cepa E. coli BL21. La expresión se realizó a diferentes temperaturas (37°C, 25°C y 16°C) y concentraciones de inductor (0.5 y 1 mM). Los resultados indicaron que la mejor expresión se consiguió incubando 16 °C y con IPTG 1mM como inductor. La raSFP producida se purificó por afinidad obteniendo un total de 0.06 mg/mL. Los resultados de ambos experimentos son el inicio para el desarrollo de medios de criopreservación basados en proteínas purificadas con una actividad biológica específica que pueda mitigar los efectos de la congelación sobre las células espermáticas.
| Main Author: | |
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| Other Authors: | |
| Format: | masterThesis biblioteca |
| Language: | spa |
| Published: |
Universidad del Atlántico
2018
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| Subjects: | Genética y mejoramiento animal - L10, Proteínas, Criopreservación, Semen, Electroforesis, Cromatografía, Espectrometría, Ganado bovino, Ganadería y especies menores, |
| Online Access: | http://hdl.handle.net/20.500.12324/35035 |
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| Summary: | Las proteínas de bajo peso molecular (<16 kDa) en el plasma seminal se han relacionado con los parámetros de calidad seminal y además con la congelabilidad del semen. Se presume que la adición de estas proteínas podría mejorar la calidad seminal post-descongelación. Como objetivo general, en este trabajo se plantea la evaluación del uso de proteínas de plasma seminal de la raza Sanmartinero en procesos de criopreservación de espermatozoides bovinos. Además, se pretende establecer un sistema heterólogo para producción de proteínas de plasma seminal que puedan ser usadas en protocolos de criopreservación seminal. Para esto, se obtuvieron fracciones cromatográficas del plasma seminal de toros criollos Sanmartinero, separadas mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Dichas fracciones se analizaron por electroforesis y se seleccionaron las fracciones IV y V. Para las pruebas de actividad biológica se evalúo la calidad seminal post-descongelación de pajillas congeladas con diferentes dosis de cada fracción. La calidad seminal post-descongelación fue evaluada en función de la motilidad individual y progresiva mediante el sistema C.A.S.A a las 0, 2 y 4 horas y la evaluación de la viabilidad espermática. Los resultados evidenciaron que al adicionar 62.5 μg x 106 espermatozoides (spz) de la fracción V y 125 μg x 106 spz de la fracción IV hubo un aumento en la viabilidad espermática del 9 y el 6 % respectivamente. Las evaluaciones de motilidad evidenciaron un aumento cercano al 34% post-descongelación y de casi el 40 % luego de dos horas de descongelación cuando se adicionaron 15.62 μg x 106 spz de la fracción V. Estos resultados demuestran que el efecto de adicionar proteínas específicas sobre la calidad seminal post-descongelación es dosis-dependiente, y que dosis bajas de las fracciones evaluadas permiten una mejoría tanto en la viabilidad como en la motilidad. En vista de los resultados anteriores se propuso la expresión heteróloga de aSFP, una de las proteínas encontradas en las fracciones IV y V. Para esto, la secuencia disponible GENGANK fue clonada en el plásmido pDass que se usó para transformar una la cepa E. coli BL21. La expresión se realizó a diferentes temperaturas (37°C, 25°C y 16°C) y concentraciones de inductor (0.5 y 1 mM). Los resultados indicaron que la mejor expresión se consiguió incubando 16 °C y con IPTG 1mM como inductor. La raSFP producida se purificó por afinidad obteniendo un total de 0.06 mg/mL. Los resultados de ambos experimentos son el inicio para el desarrollo de medios de criopreservación basados en proteínas purificadas con una actividad biológica específica que pueda mitigar los efectos de la congelación sobre las células espermáticas. |
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