Células donantes mesenquimales, agregación embrionaria y modulación de la expresión génica mediada por CRISPR/dCas9 para clonación bovina

La transferencia nuclear de célula somática (SCNT) es una técnica de reproducción asistida con gran potencial, tanto a fines de investigación básica como aplicada. Sin embargo,\na la fecha, su eficiencia continúa siendo muy baja. En bovinos, los embriones producidos mediante SCNT muestran una competencia deficiente para su desarrollo in vitro e in vivo y\ncerca del 70% falla en el proceso de implantación al ser transferidos a hembras receptoras sincronizadas.\nEl trabajo realizado en esta Tesis involucró el uso de estrategias alternativas con el fin de corregir estas deficiencias e incrementar tanto la producción como la calidad de los embriones clonados. Inicialmente, se evaluó la factibilidad de mejorar la producción in vitro de blastocistos mediante el uso de células mesenquimales de tejido adiposo (ASC), en combinación con la estrategia de agregación embrionaria. Para esto, se estableció un protocolo sencillo para el aislamiento de ASC bovinas y se confirmó el carácter mesenquimal en el 80% de las células en cultivo, mediante inmunotipificación e inducción de la diferenciación hacia otros linajes mesodérmicos.\nPosteriormente, estas células se emplearon para reconstruir embriones bovinos libres de zona pelúcida por SCNT, empleando fibroblastos adultos bovinos (FAB) como control. Además, los embriones reconstruidos se cultivaron de forma individual o de a pares, para estudiar el efecto de la agregación embrionaria. Nuestros resultados permiten confirmar que el uso de ASC como donantes de núcleo o la agregación embrionaria no son suficientes para mejorar la eficiencia en la producción de blastocistos. Además, no se observó un efecto sinérgico del uso simultáneo de ambas estrategias, aunque, sobre la base de trabajos previos, no se descarta una mejora en la tasa de nacidos vivos.\nA continuación, se diseñó y evaluó una estrategia sumamente novedosa para mitigar las fallas asociadas a la expresión génica aberrante del trofoblasto, como son la implantación y placentación deficiente de los clones. En este sentido, empleamos el sistema CRISPR/dCas9- VP160 (CRISPR-on) para inducir la expresión endógena de los genes CDX2, SMARCA4 y TFAP2C, de modo de dirigir la diferenciación a trofoectodermo (TE). Dado que a la fecha, y bajo nuestro conocimiento, no existen reportes sobre el uso de este sistema para la modulación de la expresión de genes endógenos en embriones, inicialmente estudiamos esta técnica en embriones producidos por fecundación in vitro (FIV), con el fin de trasladarla luego a embriones clonados. Mediante análisis por inmunofluorescencia se comprobó la correcta síntesis y traducción del ARNm codificante para dCas9-VP160, en embriones murinos y bovinos. Además, por ensayos de RTqPCR se comprobó que el sistema es eficiente para la inducción de la expresión de SMARCA4 dos días luego de la microinyección; aunque el efecto dejó de ser detectable a nivel de ARNm a día 4 y 7. No sólo se evidenció la modulación de la expresión en el gen diana, sino también en la de efectores que operan río abajo de éste, como es CDX2. Estos resultados alientan la aplicación de este sistema a embriones de PIV y principalmente producidos por SCNT, con el fin de corregir la expresión génica aberrante de los mismos. Considerando que una mejora en el desarrollo y calidad del TE podría mejorar el reconocimiento materno-fetal, se estima que la aplicación de esta estrategia en clones, así como en embriones producidos por otras técnicas de producción in vitro, tendría un impacto positivo sobre la placentación y, posiblemente, sobre las tasas de producción de crías vivas saludables. Se requieren análisis adicionales para confirmar esta hipótesis.

Bibliographic Details

Main Author:	Savy, Virginia
Other Authors:	Salamone, Daniel Felipe
Format:	doctoralThesis biblioteca
Language:	spa
Published:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía
Subjects:	GENETICA, CLONACION, GANADO BOVINO, EMBRIONES ANIMALES, DIVISION CELULAR, CELULAS, NUCLEO, TEJIDO ADIPOSO, METODOS DE MEJORAMIENTO GENETICO,
Online Access:	http://ri.agro.uba.ar/greenstone3/library/collection/arti/document/2020savyvirginia
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